Bend.3細胞（小鼠腦微血管內(nei) 皮細胞係）

bEnd.3細胞是一種源自BALB/c小鼠腦微血管內(nei) 皮的轉化細胞係，具有典型的內(nei) 皮細胞特性。bEnd.3細胞通過轉染表達多瘤病毒中T抗原的NTKmT逆轉錄病毒載體(ti) ，獲得了內(nei) 皮細胞特征，其形態呈現內(nei) 皮細胞樣式，喜貼壁生長。通過觀察von Willebrand因子的表達以及熒光標記的低密度脂蛋白（LDL）的攝取，可以驗證其內(nei) 皮細胞特性。

bEnd.3細胞表達多種內(nei) 皮細胞特有的抗原，包括ICAM-1、VCAM-1和MAdCAM-1。bEnd.3細胞具有MAdCAM-1、Peyer’s Patch高內(nei) 皮受體(ti) 和E-選擇素的基因表達，這些基因可以在細胞受到刺激時誘導表達。

細胞因子和脂多糖（LPS）可以刺激bEnd.3細胞，誘導其表達淋巴細胞的Peyer’s Patch高內(nei) 皮受體(ti) 、粘膜血管尋址蛋白（MAdCAM-1）和E-選擇素。這種誘導作用受到腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1）或LPS濃度和時間的影響。

MAdCAM-1在未刺激的早期代數bEnd.3細胞表麵表達，但在傳(chuan) 代超過30代後不再表達。而細胞內(nei) 粘附分子1（ICAM-1）具有持續性表達特點，並可通過LPS、IL-1和TNF-α的處理來增加表達。血管細胞粘附分子1（VCAM-1）在早期傳(chuan) 代時持續表達，但在傳(chuan) 代超過30代後停止表達。腫瘤壞死因子α（TNF-α）可在bEnd.3細胞中誘導P-選擇素的表達，且在傳(chuan) 代超過30代後表達水平進一步增加。

Bend.3細胞轉染及特性

• 經轉染表達多瘤病毒中T抗原的NTKmT逆轉錄病毒載體(ti) 。

• 表達血管性血友病因子和攝取熒光標記的LDL，證實其內(nei) 皮細胞特性。

• 通過細胞因子和LPS誘導，可以表達MAdCAM-1和E選擇素。

• 對TNF-α、IL-1和LPS的誘導是時間和濃度依賴的。

• 早期代數細胞表達MAdCAM-1和VCAM-1，但超過30代後不再表達。

• 細胞可以分泌ICAM-1，並在受到LPS、IL-1和TNF-α刺激時增加表達。

• P選擇素在受TNF-α誘導時分泌，且在細胞經過30代後分泌量增加。

BEND3小鼠腦微血管內皮細胞參數表

培養體係和條件：

• 培養(yang) 體(ti) 係：DMEM+10% FBS+1% PS

• 培養(yang) 條件：氣相：空氣（95%）+CO2（5%），溫度：37℃

• 傳(chuan) 代步驟：當細胞密度達到80%-90%時，可進行傳(chuan) 代培養(yang) 。傳(chuan) 代比例一般為(wei) 1:2到1:4。

• 凍存步驟：細胞凍存時，先進行消化並終止消化，然後離心收集細胞沉澱並加入含DMSO的凍存液，最後置於(yu) 液氮中保存。

常見問題和處理方法：

細胞形態問題：bEnd.3細胞生長較慢，低密度時呈現不規則形態，而高密度時呈現規則纖維狀。若在培養(yang) 過程中發現細胞形態異常，可能是細胞密度過低。建議在細胞鋪滿瓶底時進行傳(chuan) 代，以提高細胞密度。

細胞消化問題：

• 消化時間：隨著培養(yang) 時間的延長，bEnd.3細胞的消化時間會(hui) 增加。建議在培養(yang) 4天後傳(chuan) 代，消化時間一般為(wei) 3-5分鍾；培養(yang) 7天後傳(chuan) 代，消化時間一般為(wei) 5-10分鍾。具體(ti) 消化時間以顯微鏡下觀察細胞狀態為(wei) 準。

• 難消化問題：如遇到消化困難，可采用分次消化的方式解決(jue) 。操作方法如下：

1. 吸出原培養(yang) 液，加入PBS潤洗細胞。

2. 加入胰酶進行消化，消化3-5分鍾後加入PBS使細胞懸浮。

3. 將細胞懸液轉移到含血清的培養(yang) 基中，並吹散細胞，使其呈單顆細胞的懸浮液。

4. 繼續消化，直到細胞塊中間全部收縮變圓。

5. 終止消化，收集細胞懸液並離心，然後加入新鮮培養(yang) 基。

培養注意事項：

• 細胞密度：細胞生長具有密度依賴性，建議在細胞密度達到80%-90%時進行傳(chuan) 代。

• 換液頻率：避免頻繁換液，每隔2-3天換液或半量換液一次。

• 細胞收集：注意收集漂浮細胞，但貼壁細胞密度過高時可以丟(diu) 棄。

• 培養(yang) 基條件：細胞對溫度和pH敏感，換液前可常溫複溫培養(yang) 基4小時以上，避免使用pH改變的培養(yang) 基。

• 分次消化：如消化時間過長，可采用分次消化，切勿強行吹下細胞。

• 凍存：凍存時注意細胞密度不低於(yu) 1x10^6/ml，凍存管需標識清晰，並儲(chu) 存於(yu) 液氮中。