L-WRN細胞株（小鼠皮下結締組織細胞株）

L-WRN小鼠皮下結締組織細胞源自雄性C3H/An小鼠皮下結締組織的成纖維樣細胞。L-WRN細胞通過對L-Wnt3A（ATCC CRL-2647）細胞進行基因工程改造，轉染了含有R-spondin 3和noggin共表達載體(ti) 的細胞，從(cong) 而使其能夠穩定分泌Wnt-3A、R-spondin 3以及noggin。這些因子是培養(yang) 和研究各種哺乳動物組織幹細胞，特別是腸道類器官時不可或缺的。

L-WRN細胞株建立目的是為(wei) 了提供高效、經濟的條件培養(yang) 基。相較於(yu) 使用重組蛋白，L-WRN細胞株能夠生產(chan) 含有Wnt-3A、R-spondin 3和noggin的條件培養(yang) 基，減少了大規模培養(yang) 的成本。Wnt-3A能夠結合到卷曲受體(ti) 家族並激活β-catenin依賴性轉錄通路，而R-spondin 3作為(wei) Wnt信號通路的強效共激活劑，對於(yu) 小腸幹細胞的維持至關(guan) 重要。Noggin則作為(wei) 骨形態發生蛋白（BMP）信號的抑製劑，有助於(yu) 在體(ti) 外維持和傳(chuan) 遞小腸類器官。

L-WRN細胞株特性特征

• 基因表達：Wnt-3A、R-spondin 3 (R-海綿堿)、Noggin (諾金)

• 分泌特性：能夠同時分泌Wnt、R-spondin和Noggin蛋白

• 基因工程改造：L-WRN細胞通過R-spondin 3和noggin共表達載體(ti) 轉染L-Wnt3A細胞（ATCC CRL-2647）獲得、在含G418和潮黴素B的培養(yang) 基中篩選穩定克隆

• 條件培養(yang) 基來源：L-WRN細胞是生產(chan) Wnt-3A、R-spondin 3和noggin條件培養(yang) 基的來源
  

• 應用價(jia) 值：可用於(yu) 培養(yang) 各種哺乳動物組織幹細胞，特別適用於(yu) 腸道類器官的培養(yang) 和研究

• 由於(yu) 條件培養(yang) 基中除了Wnt3A、R-spondin 3和noggin蛋白外還含有其他因子，因此有必要用來自大親(qin) 代細胞係的對照條件培養(yang) 基來控製任何涉及Wnt3A條件培養(yang) 基的實驗使用L-WRN細胞（如CRL-3276）製備的條件培養(yang) 基能提供相對完整且高濃度的蛋白質，是一種更為(wei) 經濟高效的選擇

L-WRN細胞株參數表

L-WRN小鼠皮下結締組織細胞株培養教程

細胞複蘇

• 將凍存管（含1 mL L-WRN細胞懸液）在37°C水浴中快速搖晃解凍。
  

• 加入4 mL預熱的培養(yang) 基，混合均勻。

• 在1000 rpm條件下離心3分鍾，棄去上清液。
  

• 加入1-2 mL培養(yang) 基後吹勻。

• 將L-WRN細胞懸液加入培養(yang) 瓶或6 cm培養(yang) 皿中，加入適量培養(yang) 基（約4 mL）。
  

• 過夜培養(yang) ，第三天換液並檢查細胞密度。

細胞傳代

• 當L-WRN細胞密度達到80%-90%時進行傳(chuan) 代。
  

• 棄去上清：用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗L-WRN細胞1-2次。
  

• 消化：加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA，37°C消化1-3分鍾，觀察細胞變圓並脫落。

• 終止消化：加入2-3 mL完全培養(yang) 基終止消化，輕輕打勻。

• 離心：1000 rpm離心5分鍾，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yang) 基後吹勻。

• 分瓶：按1:2比例分到新的含8 mL培養(yang) 基的培養(yang) 瓶中，置於(yu) 培養(yang) 箱中培養(yang) 。

細胞凍存

• 收集L-WRN細胞及培養(yang) 液，裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4分鍾。
  

• 棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。

• 根據L-WRN細胞數量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度達到5×10^6 ~ 1×10^7 cells/mL。
  

• 將細胞懸液分裝入凍存管中，標記清楚。
  

• 逐步降溫至-80°C，然後轉移至液氮中長期保存。

注意事項

• 無菌操作：始終保持無菌操作，避免L-WRN細胞汙染。

• 培養(yang) 基更換：定期更換培養(yang) 基，通常每2-3天更換一次。

• 條件培養(yang) 基製備：收集72小時L-WRN細胞培養(yang) 上清，0.2 μm過濾，儲(chu) 存於(yu) -20°C或-80°C，避免反複凍融。

• 實驗對照：使用大親(qin) 代細胞係的對照條件培養(yang) 基，控製實驗變量。

L-WRN細胞在不同條件下的表現

1. 培養條件

• 標準培養(yang) 條件：L-WRN細胞在DMEM培養(yang) 基中，添加10% FBS、0.5 mg/mL G418、0.5 mg/mL Hygromycin B和青黴素/鏈黴素（PS）進行培養(yang) ，生長環境為(wei) 37°C，5% CO2，飽和濕度。

• 生長特性：L-WRN細胞在上述條件下表現出良好的貼壁生長特性，細胞形態呈成纖維細胞樣。

2. 條件培養基的影響

• 條件培養(yang) 基：L-WRN細胞能夠分泌Wnt-3A、R-spondin 3和Noggin蛋白，這些蛋白對於(yu) 腸道類器官的培養(yang) 至關(guan) 重要。使用L-WRN細胞製備的條件培養(yang) 基可以提供相對完整和高滴度的蛋白質，是一種經濟高效的替代品。

3. 非靶向和靶向蛋白質組學分析

• 蛋白質組學分析：通過結合非靶向和靶向蛋白質組學分析，可以詳細了解L-WRN細胞分泌的蛋白質組。現有的測量方法主要是熒光素酶報告基因檢測和其他蛋白質組學技術。