3D4/21細胞（豬肺泡巨噬細胞）

3D4/21豬肺泡巨噬細胞係於(yu) 1998年從(cong) 27日中齡豬的肺中分離獲得，母細胞為(wei) 3D4豬肺泡巨噬細胞。通過pSV3neo溶液轉染並攜帶新黴素抗性基因和SV40大T實現了永生化。轉染後的細胞經過G418篩選後，成功克隆出多個(ge) 亞(ya) 群，包括3D4/2、3D4/21和3D4/31。每個(ge) 亞(ya) 群都在非磷酸酯酶活性和發揮作用方麵的其中，3D4/21細胞亞(ya) 群在病毒複製方麵極為(wei) 突出，能夠有效地產(chan) 生牛腺病毒3型（BAV-3），並添加二甲基亞(ya) 硫酰胺；3D4/21細胞係具有典型的巨噬細胞形態，表現出強烈的貼壁生長特性，全麵增強免疫學、病毒學及其他生物醫學。

3D4/21細胞特性特征

• 轉染質粒：3D4/21細胞使用pSV3neo質粒轉染，該質粒攜帶新黴素抗性基因和SV40大T抗原。

• 酶活性：3D4/21細胞在非特異性酯酶活性和吞噬作用方麵表現出陽性反應。

• 病毒易感性：可感染多種病毒，包括牛腺病毒3型（BAV-3）、非洲豬瘟病毒（ASFV）、人副流感病毒3；Swinepox病毒；水皰性口炎新澤西病毒；豬腺病毒；單純皰疹病毒1型；非洲豬瘟病毒；偽(wei) 狂犬病病毒；痘苗病毒；豬水泡病病毒。

• 克隆3D4/21細胞對非洲豬瘟病毒的複製能力較強，添加DMSO可進一步提高其複製能力。

• 基因表達：由於(yu) 轉染了SV40大T抗原，3D4/21細胞係在增殖和存活方麵具有優(you) 勢，能夠持續生長並保持穩定的表型。

• 抗性基因：3D4/21細胞攜帶的新黴素抗性基因使得該細胞係在含有G418的培養(yang) 基中能夠存活並增殖。

• 克隆3D4/21可以產(chan) 生牛腺病毒3型（BAV-3），其滴度明顯高於(yu) 克隆3D4/2和3D4/31。

• 與(yu) 其他克隆相比，添加DMSO提高了克隆3D4/21複製非洲豬瘟病毒（ASFV/Lillie）田間分離株的能力。

3D4/21細胞參數表

3D4/21豬肺泡巨噬細胞培養教程

細胞複蘇步驟

• 準備4 mL預熱的完全培養(yang) 基，加入到15 mL離心管中。
  

• 從(cong) 液氮或-80℃冰箱中取出凍存的3D4/21細胞，迅速放入37℃水浴中解凍，輕輕搖晃，解凍過程約1分鍾。

• 解凍後，將3D4/21細胞轉移至含預熱培養(yang) 基的離心管中，1000 rpm離心5分鍾。
  

• 吸棄上清液，輕輕重懸細胞於(yu) 2 mL完全培養(yang) 基中。

• 將重懸細胞轉移至T25培養(yang) 瓶中，放入37℃恒溫培養(yang) 箱，觀察3D4/21細胞的生長狀態。

• 24小時後，檢查3D4/21細胞是否已貼壁並健康生長。如果需要，吸棄舊培養(yang) 基，加入新鮮的完全培養(yang) 基。
  

細胞傳代步驟

• 當3D4/21細胞的匯合度達到80%-90%時，吸棄培養(yang) 基，並用無菌PBS輕輕洗滌一次，去除殘餘(yu) 培養(yang) 基和血清。
  

• 向細胞培養(yang) 瓶中加入1 mL 0.25%胰酶溶液，放入37℃培養(yang) 箱中消化1-2分鍾。
  

• 觀察3D4/21細胞收縮、變圓後，迅速加入1 mL完全培養(yang) 基中止消化，並輕拍培養(yang) 瓶，使細胞脫落。

• 將細胞轉移至15 mL離心管中，1000 rpm離心5分鍾。
  

• 吸棄上清液後，用完全培養(yang) 基重懸細胞，按照1:2至1:5的比例分裝至新的培養(yang) 瓶中，繼續培養(yang) 3D4/21細胞。

細胞凍存步驟

• 按照傳(chuan) 代方法收集3D4/21細胞沉澱，並取少量細胞進行計數。
  

• 用預冷的凍存液（90%完全培養(yang) 基 + 10% DMSO）重懸細胞，細胞濃度調整為(wei) 1 × 10^6個(ge) /mL。
  

• 將細胞懸液分裝至凍存管中，每管約1.2 mL。

• 將凍存管放入程序凍存盒中，緩慢降溫至-80℃過夜，然後轉移至液氮罐中進行長期保存。
  

注意事項

• 在消化過程中，胰酶消化時間要控製在適當範圍，以避免過度消化導致3D4/21細胞損傷(shang) 。

• 所有操作過程應嚴(yan) 格保持無菌條件，避免細胞汙染。

• 細胞複蘇和傳(chuan) 代後，應盡快觀察3D4/21細胞狀態，保證細胞在良好狀態下繼續培養(yang) 。