永生化支氣管上皮細胞

由於(yu) 正常和患病原代支氣管上皮細胞對數量有限、供體(ti) 之間存在顯著差異以及其有限的增殖能力，正常和患病原代支氣管上皮細胞培養(yang) 物的使用受到限製。此外可用的細胞係已使用病毒基因轉化或源自腫瘤，不保持親(qin) 本細胞的形態和表型。永生化支氣管上皮細胞壽命相對原代支氣管上皮細胞較長，核型穩定，表型與(yu) 原代親(qin) 本細胞相似。

人氣道上皮細胞係 NuLi-1是由正常肺上皮細胞通過 HPV-16 E6/E7-LXSN 和 hTERT-LXSN 雙重逆轉錄病毒感染而獲得。人氣道上皮細胞係 CuFi-1 ( 、CuFi-4 、CuFi-5 和 CuFi-6是由囊性纖維化患者肺上皮細胞通過 HPV-16 E6/E7-LXSN 和 hTERT-LXSN 或 pBabe-hygro-hTERT 雙重逆轉錄病毒感染而獲得。

細胞培養方案

用單克隆泛細胞角蛋白抗體(ti) （綠色）和 Hoechst 染料（藍色）染色, 用單克隆泛細胞角蛋白抗體(ti) （綠色）和 Hoechst 染料（藍色）染色

所需材料

支氣管上皮生長培養(yang) 基 (BEGM)，無血清（Lonza BEGM BulletKit、 CC-3170）

G-418

人胎盤膠原蛋白 IV 型，（Sigma，C-7521）

胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA 溶於(yu) HBSS）

經細胞培養(yang) 測試的 DMSO 

胎牛血清 

杜氏磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水 

完全生長培養基的製備

這些細胞係的基礎培養(yang) 基是 BEBM。要製作完全生長培養(yang) 基 (BEGM)，請將以下成分添加到基礎培養(yang) 基中：

SingleQuot 添加劑（隨 BEGM BulletKit 提供）

50 微克/毫升 G-418

注意：

不使用 BEGM 試劑盒附帶的慶大黴素-兩(liang) 性黴素 B。

冷凍細胞處理程序和培養啟動

為(wei) 確保最高水平的活力，收到後應盡快解凍小瓶並開始培養(yang) 。如果到達後需要儲(chu) 存冷凍培養(yang) 物，請將小瓶儲(chu) 存在液氮蒸汽相中，而不是-70°C 下。儲(chu) 存在 -70°C 下會(hui) 導致活力喪(sang) 失。

培養(yang) 瓶應至少提前 18 小時用 60 µg/mL 人胎盤膠原蛋白 IV 型溶液預塗，然後風幹並用杜氏磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水衝(chong) 洗 2 至 3 次。

準備一個(ge) 裝有推薦的完全培養(yang) 基的培養(yang) 瓶。在加入培養(yang) 瓶內(nei) 容物之前，應將裝有生長培養(yang) 基的容器放入培養(yang) 箱中至少 15 分鍾，以使培養(yang) 基達到正常 pH 值（7.0 至 7.6），並避免在細胞恢複過程中培養(yang) 基堿性過高。

將小瓶放入 37°C 水浴中輕輕攪拌以解凍。為(wei) 降低汙染的可能性，請勿將 O 形圈和瓶蓋放入水中。解凍應快速進行（約 2 分鍾）。

解凍後立即將小瓶從(cong) 水浴中取出，浸入或噴灑 70% 乙醇進行消毒。此後的所有操作都應在嚴(yan) 格的無菌條件下進行。

將小瓶內(nei) 容物轉移到含有 9.0 mL 完全培養(yang) 基的離心管中，並以約 125 xg 的速度離心細胞懸浮液 5 至 7 分鍾。

棄去上清液，用新鮮的生長培養(yang) 基重懸細胞（請參閱批次特定信息以了解推薦的稀釋比例）。將此懸浮液加入準備好的培養(yang) 容器中。

將培養(yang) 物放入 37°C、5% CO 2、加濕的培養(yang) 箱中孵育。

傳代培養程序

給出的體(ti) 積適用於(yu) 75 cm2培養(yang) 瓶。對於(yu) 其他尺寸的培養(yang) 瓶，應按比例增加或減少所需的解離培養(yang) 基量。

注意：

培養(yang) 瓶應至少提前 18 小時用 60 µg/mL 人胎盤膠原蛋白 IV 型溶液預塗，然後風幹並用杜氏磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水衝(chong) 洗 2 至 3 次。

每 2 至 3 天更新一次培養(yang) 基（不要超過 3 天），以維持培養(yang) 中的細胞。

請參閱產(chan) 品信息表，了解細胞應在何種濃度下進行傳(chuan) 代培養(yang) 。當確定細胞已準備好進行傳(chuan) 代培養(yang) 時，請繼續下一步。

取出並丟(diu) 棄介質。

向燒瓶中加入2.0至3.0 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，在倒置顯微鏡下觀察細胞，直至細胞層分散（通常在5至10分鍾內(nei) ）。

為(wei) 了去除胰蛋白酶-EDTA 溶液，在杜氏磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水中加入 2.0 至 3.0 mL 1% FBS，然後輕輕吹吸細胞。

將細胞懸浮液轉移到 15 mL 離心管中，以約 125 xg 旋轉 5 至 10 分鍾。

棄去上清液，用新鮮生長培養(yang) 基重懸細胞。將適當份量的細胞懸浮液加入新的培養(yang) 容器中。請參閱產(chan) 品說明書(shu) ，了解推薦的接種濃度。

將培養(yang) 物放入 37°C、5% CO 2、加濕的培養(yang) 箱中孵育。

注意：

為(wei) 避免細胞結塊，在等待細胞分離時，請勿通過敲擊或搖動燒瓶來攪動細胞。將燒瓶置於(yu) 37°C 下以促進細胞分散。

冷凍保存介質

在以下培養(yang) 基中冷凍細胞：添加 10% DMSO 和 30% 胎牛血清的 BEGM。將小瓶儲(chu) 存在液氮蒸汽中。避免將小瓶浸入液氮中。