Barrett永生化食管上皮細胞

原代Barrett食管上皮細胞在培養(yang) 中的壽命有限，並且通常不含有可導致Barrett食管癌變的基因異常，這大大限製了它們(men) 作為(wei) 該疾病進展模型的使用。相比之下， 永生化Barrett食管上皮細胞含有穩定、明確的細胞周期和基因異常，壽命較長，並且在核型、形態和表型上與(yu) 原代親(qin) 本細胞相似。
Barrett 食管細胞係來源於(yu) 從(cong) 非發育不良化生區域獲得的內(nei) 窺鏡活檢標本，並用逆轉錄病毒表達載體(ti) pLXSN-hTERT 轉導。

細胞培養方案

用單克隆泛細胞角蛋白抗體(ti) （綠色）和 Hoechst 染料（藍色）染色, 用單克隆泛細胞角蛋白抗體(ti) （綠色）和 Hoechst 染料（藍色）染色

所需材料

• MCDB-153 培養(yang) 基（Sigma，M7403）

• 氫化可的鬆

• 重組人表皮生長因子

• 霍亂(luan) 毒素

• 腺嘌呤

• 牛垂體(ti) 提取物

• 胰島素-轉鐵蛋白-亞(ya) 硒酸鈉補充劑（Sigma，I1884）

• 穀氨酰胺

• 胎牛血清（ 30-2020） 

• 杜氏磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水 (  30-2200 ) 

• 胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA 溶於(yu) HBSS）（ 30-2101） 

• 經細胞培養(yang) 測試的 DMSO (  4-X ) 

• RPMI-1640 培養(yang) 基 (  30-2001 ) 

完全生長培養基的製備

這些細胞係的基礎培養(yang) 基是 MCDB-153。要製作完全生長培養(yang) 基，請將以下成分添加到基礎培養(yang) 基中：

• 0.4 μg/mL 氫化可的鬆

• 20 ng/mL 重組人表皮生長因子

• 1 nM 霍亂(luan) 毒素

• 20 毫克/升腺嘌呤

• 140 μg/mL 牛垂體(ti) 提取物

• 0.1% 胰島素-轉鐵蛋白-亞(ya) 硒酸鈉補充劑

• 4 mM 穀氨酰胺

• 5%胎牛血清

冷凍細胞處理程序和培養啟動

為(wei) 確保最高水平的活力，收到後應盡快解凍小瓶並開始培養(yang) 。如果到達後需要儲(chu) 存冷凍培養(yang) 物，請將小瓶存放在液氮蒸汽中，而不是 -70°C 下。在 -70°C 下儲(chu) 存將導致活力喪(sang) 失。

有關從每批原代Barrett上皮細胞中回收的活細胞總數，

準備一個(ge) 裝有推薦的完全培養(yang) 基的培養(yang) 瓶。在加入小瓶內(nei) 容物之前，應將裝有生長培養(yang) 基的容器放入培養(yang) 箱中至少 15 分鍾，以使培養(yang) 基達到正常 pH 值（7.0 至 7.6），並避免在細胞恢複期間培養(yang) 基堿性過高。

• 將小瓶放入 37°C 水浴中輕輕攪拌以解凍。為(wei) 降低汙染的可能性，請勿將 O 形圈和瓶蓋放入水中。解凍應快速進行（約 2 分鍾）。

• 解凍後立即將小瓶從(cong) 水浴中取出，浸入或噴灑 70% 乙醇進行消毒。從(cong) 此時起，所有操作都應在嚴(yan) 格的無菌條件下進行。

• 將小瓶內(nei) 容物轉移到含有 9.0 mL 完全培養(yang) 基的離心管中，並以約 125 xg 的速度離心細胞懸浮液 5 至 7 分鍾。

• 棄去上清液，用新鮮生長培養(yang) 基重懸細胞（請參閱批次特定信息以了解推薦的稀釋比例）。確定活細胞數量，並將適量懸浮液加入培養(yang) 瓶中。

• 將培養(yang) 物放入 37°C、5% CO 2、加濕的培養(yang) 箱中孵育。

傳代培養和培養物的維持

• 給出的體(ti) 積適用於(yu) 75 cm2培養(yang) 瓶。對於(yu) 其他尺寸的培養(yang) 瓶，應按比例增加或減少所需的解離培養(yang) 基量。

• 注意：為(wei) 避免細胞結塊，在等待細胞分離時，請勿通過敲擊或搖動燒瓶來攪動細胞。為(wei) 促進細胞分散，請將燒瓶置於(yu) 37°C 下。

• 每 2 至 3 天更新一次培養(yang) 基，以維持培養(yang) 中的細胞。

冷凍保存介質

在以下培養(yang) 基中冷凍細胞：RPMI-1640 培養(yang) 基，添加 10% 胎牛血清和 10% DMSO。將小瓶儲(chu) 存在液氮蒸汽中。避免將小瓶浸入液氮中。